灵芝来源的活性miRNA的筛选及验证——以KRAS基因为靶点--毕业论文附表.xlsx

胰腺癌是最致命的癌症之一。不幸的是，现有的治疗胰腺癌的化疗药物会产生明显的副作用，并且胰腺癌容易对这些化疗药物产生耐药性。因此，迫切需要开发新的药物，为胰腺癌患者提供更多的治疗选择。与传统的蛋白质靶向和基于DNA的药物相比，基于核糖核酸（RNA）的药物由于其独特的物理化学和生理特性，近年来受到了广泛的关注。 KRAS突变在肿瘤中占比非常高（如胰腺癌90%），但直接靶向KRAS的小分子药物研发困难。灵芝是一种传统中药，具有多种药理活性，但其来源的miRNA研究较少。本课题基于灵芝来源的miRNA在胰腺癌新药开发中的潜力，聚焦于KRAS基因，旨在从灵芝miRNA中筛选出能下调KRAS基因的miRNA，为胰腺癌新药开发提供了新思路。在之前的研究中，我们通过高通量测序鉴定出了灵芝中存在的milRNAs共168个。首先我们利用现有的四个预测网站（MiRanda、RNAhybrid、PITA和Targetscan）对这168个miRNA进行初步预测分析。对以上四个网站的结果取交集进行汇总后，初步筛选出48个miRNA。 随后，为了进一步验证这48个miRNA靶向KRAS基因的活性，我们通过qRT-PCR实验进行验证。首先我们成功构建了25个miRNA载体质粒，质粒扩繁后进行了去内毒素提取，然后转染到PANC-1人胰腺癌细胞中，孵育36h后提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，最后进行qRT-PCR实验。结果表明，miR-0001和miR-0002转染PANC-1细胞后可下调KRAS基因的表达，其余23个miRNA均表现出上调的作用。 最后，我们对筛选出来的miR-0001和miR-0002进行药效评价。在CCK8细胞增殖实验中，细胞分别转染mimics0001，mimics0002和mimics0000。mimics0000作为阴性对照。结果表明，mimics0001和mimics0002起到抑制PANC-1细胞增殖的作用。细胞转染mimics0001和mimics0002后的细胞抑制率分别是40.72%和20.49%。在体内裸鼠成瘤实验中，给药14天后，mimics0001组、mimics0002组和吉西他滨组的瘤体积明显小于mimics0000组和生理盐水组的瘤体积。mimics0000组的抑瘤率是29.94%，而mimics0001组、mimics0002组和吉西他滨组的抑瘤率分别是87.90%，81.69%和80.99%，与mimics0000组间均有统计学差异（P<0.01）。说明mimics0001和mimics0002起到明显抑制胰腺癌肿瘤的作用。 本课题首次提出灵芝miRNA跨界调控人KRAS基因的设想，为中药来源的miRNA在肿瘤治疗中的应用提供了新思路,同时也为从天然药物中挖掘功能性miRNA提供了实例。